??????? 一、分離模式
??????? 選擇色譜柱的首要任務(wù)是選擇分離模式。分離分子的方法有很多，其中應(yīng)用最廣泛的包括反相、正相、親水相互作用、離子交換和尺寸排阻 HPLC。還有一些不太常見(jiàn)但更專業(yè)的分離模式，例如使用手性固定相或流動(dòng)相的特定手性色譜。
??????? 反相色譜柱通常用于非極性或弱極性有機(jī)化合物，它包含非極性固定相（如 C18），通常與極性流動(dòng)相配對(duì)。恒譜生C18 AQ 反相色譜柱在100%水下?lián)碛谐酵惍a(chǎn)品的壽命，適于極性較大的物質(zhì)在高水相條件下的分析。但是該方法不適合應(yīng)用于蛋白質(zhì)，流動(dòng)相通常含有低 pH 值的乙腈或甲醇，可能會(huì)使蛋白質(zhì)變性，因此會(huì)產(chǎn)生偽峰或?qū)е碌鞍踪|(zhì)聚集和色譜柱堵塞。
?
??????? 二、柱長(zhǎng)
??????? 確定分離模式和色譜類型后，請(qǐng)考慮色譜柱長(zhǎng)度。理想的柱長(zhǎng)在某種程度上取決于您的特定樣品和分離模式。一般來(lái)說(shuō)，更長(zhǎng)的色譜分析柱需要更長(zhǎng)的運(yùn)行時(shí)間，但會(huì)產(chǎn)生更好的分離效果。柱長(zhǎng)（有時(shí)稱為“床高”）對(duì)于根據(jù)大小分離蛋白質(zhì)特別重要。
??????? 三、填料的大小和類型
??????? HPLC 柱床由直徑通常為 2 至 10 μm 的球形功能顆粒構(gòu)成。小于 2 μm 的粒徑用于UHPLC，超高壓液相色譜是在非常高的壓力下運(yùn)行，因此它使用比 HPLC 更小的顆粒。恒譜生2μm硅膠基質(zhì)色譜填料，孔分布均勻、抗壓強(qiáng)度高，由于表面羥基活性高所以在中高壓情況下能達(dá)到快速分離純化的效果。一般而言，較小的粒徑可提供更高的分離率——但需要注意的是背壓也更大，以便將流動(dòng)相泵入密度更大的色譜柱。
?
??????? 三、色譜填料的材料
??????? 常見(jiàn)的選擇有二氧化硅、羥基磷灰石和交聯(lián)聚合物樹(shù)脂。常見(jiàn)的疏水烷基鏈有 C4、C8 和 C18 等長(zhǎng)度。通常，該材料對(duì)目標(biāo)分析物具有一定程度的選擇性——做出這種選擇對(duì)于優(yōu)化分離度很重要。例如，C18 更常用于分離肽或小分子，而 C4 更適用于蛋白質(zhì)。
??????? 技術(shù)發(fā)展也產(chǎn)生了新的粒子類別。一種稱為表面多孔顆粒 (SPP) 或核殼顆粒的新型二氧化硅基材料有望實(shí)現(xiàn)通過(guò)2 μm的粒徑實(shí)現(xiàn)更高的分離效率。通常，常規(guī)粒徑小于 2 μm 的 HPLC 色譜柱需要專門的 UHPLC 泵或系統(tǒng)來(lái)處理較高的背壓。與球形和全多孔的傳統(tǒng)二氧化硅顆粒不同，SPP 顆粒由一個(gè)實(shí)心二氧化硅核組成，其上覆有多孔二氧化硅殼，這些顆粒的優(yōu)點(diǎn)是它們表現(xiàn)出像 2 微米顆粒一樣的效率，顆粒尺寸從 2.6 微米及以上，但在略高于一半的背壓下運(yùn)行。
發(fā)布于: 2022-03-11